游戏背景与同名电影剧情并行，蜘蛛侠正试图寻找杀害班叔叔（Uncle Ben）的凶手。游戏中将有蜘蛛侠系列中各种反派角色登场，并包含多名新旧角色。在游戏中登场的知名反派角色包括猎人克拉文（Kraven the Hunter）、绿魔（Green Goblin）、电光人（Electro）、金并（Kingpin）、黑猫（Black Cat）、屠杀（Carnage）和成为震撼者（Shocker）之前的贺曼·舒兹（Herman Shultz）。
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